El enigma del plegado de la fibra de cromatina in vivo | EMBO reports

Delphine Quenet 1 , James McNally1 y Yamini Dalal 1 Laboratory of Receptor Biology and Gene Expression, National Cancer Institute, Bethesda, Maryland, USA

El DNA en una célula humana es de aproximadamente 2 m de longitud, pero se compacta en núcleos eucariotas de alguna micras de tamaño. Para lograr este nivel de compactación, el ADN es primero envuelto en nucleosomas, que luego se cree que se pliegan en fibras y bucles. La unidad basal de plegado, es una estructura de “cuentas de collar” de unos 10 nm observada en todas las células eucariotas (Fig. 1A ; revisado en [1]). La fibra de 10 nm posteriormente se pliega en estructuras secundarias y terciarias, cuya naturaleza ha estado en el centro de un acalorado debate durante casi 30 años[2].

Los modelos de organización de la cromatina. ( A ) 10 nm fibra. ( B ) Vista lateral de una fibra de 30 nm o solenoide. ( C ) desde arriba hacia abajo del solenoide. ( D ) en zig-zag modelo de la fibra de 30 nm. ( E ) interdigitación de dos fibras de 10 nm (azul contra el verde) formando un boustrophedon. Círculos numerados son nucleosomas en una matriz; flecha roja sigue el camino de la DNA; flecha azul representa un promotor de gen.

La primera descripción convincente de la fibra de cromatina compactada interfásica de 30 nm, que se encuentra en todos los libros de texto, se originó a partir de un estudio seminal por Finch y Klug, quien utilizó microscopía electrónica de transmisión y difracción de rayos X para investigar nucleofilaments extraídos de células. Ahora, casi 40 años después de que Finch y Klug propuesieran su conocido modelo de “solenoide”, una serie de artículos, entre ellos uno publicado en este número de EMBO reports [3], han puesto en duda la existencia de las fibras de fromatina de 30 nm.

Estos datos […] contradicen décadas de trabajo previo que abogaba por la presencia de fibras de cromatina de 30 nm y más gruesas

En su estudio original, Finch y Klug encontraron que la cromatina extraída apareció como una fibra helicoidal ‘solenoide’ de 30 nm de ancho, con una distribución radial de los nucleosomas adyacentes y enlazados por DNA linkers (DNA enlazante) todo bobinado continuamente alrededor de un eje central ( Fig. 1B,C; [4]). Esta simple hélice de un sólo inicio requiere la histona H1 por su estabilidad, y en ausencia de H1 se derrumba de nuevo en la fibra de 10 nm primaria. Más tarde, la crio-microscopía electrónica y análisis de modelado por ordenador mostró que las variaciones naturales en la longitud del ADN enlazador y regiones libres de nucleosomas in vivo  afectan a la regularidad de la fibra de 30 nm [5]. Estos datos apoyaron un modelo alternativo de organización de la fibra de cromatina, es decir, la hélice acordeón de doble inicio que contiene una disposición interdigitada de nucleosomas adyacentes, con el ADN linker recto cruzando el espacio intersticial (Fig.1D).

Este modelo representa correctamente cómo se pliega una fibra de cromatina tetra-nucleosomal in vitro [26]. Los datos in situ también revelaron la existencia de fibras de cromatina de 30 nm en el espermatozoide de estrellas de mar, los eritrocitos de pollo y células fotorreceptoras del ratón a través de varios métodos ópticos, por ejemplo, microscopía electrónica de transmisión, la microscopía crio-electrónica, formación de imágenes de enrgía espectroscópica o marcado inmunoelectrónica (revisado en [2]). Además, rastros tridimensionales de fibras de cromatina de imágenes de microscopía electrónica a partir de  núcleos G1 seccionados en serie proporcionaron evidencias de fibras con diámetros no sólo de 30 nm, sino también 60-80 nm y 100-130 nm, que parecían haberse formado por enrollamiento progresivo de la fibra de 30 nm [7]. Además, los análisis en células vivas, donde los artefactos de aislamiento o fijación no pueden surgir, revelaron segmentos marcados de dominios de cromatina descondensada en estructuras de collar con activación transcripcional, cuya longitud total era coherente con una fibra 80-100 nm [8].

Sin embargo, los avances de la crio-microscopía electrónica, de la dispersión de rayos X de ángulo corto (SAXS) y de las imágenes de energía espectroscópica presentan argumentos convincentes a favor de un núcleo eucariótico compuesto casi exclusivamente de fibras de 10 nm. El análisis de cromosomas mitóticos in situ por crio-microscopía electrónica y SAXS han encontrado fibras de cromatina 10 nm pero no otras estructuras [910], aunque las interacciones entre las fibras adyacentes que conducen a una estructura más compacta se describen en el mismo estudio. Además, un estudio de imagenes por energía espectroscópica de varios tipos de células y heterocromatina constitutiva no reveló la fibra de 30 nm [11]. Por último, los datos presentados en este número de EMBO Reports, así como un estudio publicado en el Núcleus, avalan aún más el argumento de que la fibra de 30 nm no existe [312].

La formación de imágenes de energía espectroscópica es un enfoque espectrográfico que puede distinguir átomos de fósforo, y permitir así una “marca” de la trayectoria del ADN en una fibra de cromatina. Al utilizar este método, Fussner y sus colegas han encontrado que a pesar de que pueden detectar aproximadamente fibras de de cromatina de 24 nm en esperma de estrella de mar  -sirviendo como control para la mayor parte de estructuras de cormatina compacta-  en cultivos de fibroblastos de embriones de ratón y tejidos embrionarios de ratón nativo éstas tenían casi exclusivamente una organización de fibras 10 nm. Más provocativamente aún, Joti y sus colegas han utilizado crio-microscopía electrónica y ultra-SAXS para mostrar que los datos de SAXS anteriores indicativos de fibras potencialmente de 30 nm se pueden atribuir a la contaminación de los ribosomas, que están dispuestas en una periodicidad de 30 nm cuando se cubren preparaciones de cromatina mitótica e interfásica. En efecto, cuando los cromosomas y los núcleos se lavaron exhaustivamente para eliminar los ribosomas, sólo los picos de 6 nm y 11 nm permanecen en el perfil de SAXS, lo que representa nucleosomas individuales y la fibra de cromatina 10 nm, respectivamente.

… La diferencia funcional entre fibras de cromatina de 10 y 30 nm  es profunda

Estos datos contradicen fundamentalmente décadas de trabajos anteriores que han abogado por la presencia de fibras de cromatina de 30 nm y más gruesas. ¿Hay alguna manera de conciliar los dos puntos de vista opuestos? Como se sugirió anteriormente, una posible respuesta podría ser que las condiciones usadas para estudios de extracción de cromatina favorecieron el montaje de la fibra de 30 nm que Fussner y colaboradores encontraron en esperma de estrella de mar -por ejemplo, el magnesio, cloruro de sodio y las concentraciones de cromatina en tales estudios eran mucho más bajos que los que se encuentran in vivo.

Los estudios de microscopía electrónica anteriores también están sujetos a la duda ya que los métodos de fijación o tinción podrían generar fibras más gruesas debido a los artefactos del entrecruzamiento. También es concebible que los estudios que utilizan la microscopía óptica o la microscopía electrónica de transmisión aislada menoscabaran las fibras de 10 nm debido a que su intensidad de tinción era demasiado débil respecto de la alta señal de las fibras de 30 nm, más densas. La cuestión es más desconcertante si se considera algunos de los estudios de células intactas en el que las muestras no fueron ni teñidas ni fijadas. La explicación más simple podría ser que es casi imposible distinguir entre dos fibras discontinuas de 10 nm que se entrelazan en un polímero fundido, plegado de un “modo boustrophedon” o reforzado por contra con proteínas, y una fibra contigua de 30 nm compuesta de helices de un inicio o de dos (Fig. 1E).

¿Importa si la cromatina se organiza como una fibra de 10 nm o de 30 nm? Aunque pueda parecer un argumento esotérico, la diferencia funcional entre fibras de cromatina de 10 y 30 nm es profunda. La teoría de la fibra de 30 nm fue satisfactoria precisamente porque se consideró que el genoma en el estado de reposo transcripcional sería mantenido por la falta de acceso al ADN (Fig. 1). Las ARN polimerasas o los activadores de la transcripción no podrían alcanzar fácilmente un gen enterrado dentro del núcleo solenoidal sellado por la histona H1.

Por el contrario, el emergente modelo de fibra de 10 nm es un país libre para todos, con todos los targets posibles accesibles. En este escenario, la regulación génica depende en gran medida de la afinidad por un sitio local de la cromatina, y quizás también de la velocidad a la que puede ser alcanzado ese sitio en función de la densidad local de las fibras de 10 nm. Esta hipótesis está apoyada por los datos ENCODE que demuestran que grandes zonas del genoma, que anteriormente se consideraban en reposo, son accesibles y transcripcionalmente activas, apoyando así un cambio paradigmático en nuestra visión de la estocástica unión cromatina-proteinas in vivo.

Referencias

1, Olins DE et al ( 2003 ) Nat Rev Mol Cell Biol 4 : 809-814

2, Grigoryev SA, Woodcock CL ( 2012 ) Exp Res Celular 318 : 1448-1455

3. Fussner E et al ( 2012 ) EMBO Rep (en prensa)

4. Finch JT, Klug A ( 1976 ) Proc Natl Acad Sci EE.UU. 73 : 1897-1901

5. Horowitz RA et al ( 1994 ) J Cell Biol 125 : 1-10

6. Schalch T et al ( 2005 ) Naturaleza 436 : 138-141

7- Belmont AS, Bruce K ( 1994 ) J. Cell Biol. 127 : 287-302

8. Tumbar T et al ( 1999 ) J Cell Biol 145 : 1341-1354

9. Eltsov M et al ( 2008 ) Proc Natl Acad Sci EE.UU. 105 : 19732-19737

10. Y Nishino et al ( 2012 ) EMBO J. 31 : 1644-1653

11. Ahmed et al ( 2010 ) PLoS ONE 5 : e10531

12. Joti Y et al ( 2012 ) Núcleus 3

El enigma de plegado de fibra de cromatina in vivo: Artículo: EMBO informes.

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